تحوي مكتبة المسجد النبوي 250 مصحفًا مخطوطًا دوّنت على مر العصور السالفة، إضافة إلى العديد من المخطوطات والكتب النادرة التي يتاح للزائرين الاطلاع عليها، ضمن الخدمات المعرفية والإرشادية التي هيأتها الهيئة العامة للعناية بشؤون المسجد النبوي للزائرين على مدار العام.
ويحوي قسم المخطوطات بمكتبة المسجد النبوي 4052 مخطوطة، إضافة إلى 4600 مخطوطة مصوّرة، وأكثر من 260 ألف مخطوط رقمي، فضلًا عن 200 مصحف مطبوع، وكذلك 7 آلاف كتاب نادر، يُعنى بها بأحدث الأساليب التقنية للمحافظة على جودة صفحاتها، باستخدام 5 أجهزة حديثة للترميم والتعقيم، وحفظها في أماكن مخصصة.
وتقع مكتبة المسجد النبوي التي تأسست عام 1352هـ، داخل المسجد النبوي وتضمّ مؤلفات يعود تاريخ وقفها على المسجد النبوي قبل إنشاء المكتبة، كما يسمح لجميع الزائرين بالاستفادة من المكتبة والخدمات المقدمة فيها، وقد بلغ عدد زائريها خلال العام الماضي 110 آلاف زائر، كما تضمّ العديد من الأقسام، تشمل قسم المطالعة الذي يحوي قاعات للقراءة والاطلاع للرجال، وأخرى للنساء، وللأطفال، كما تحوي قسمًا للمخطوطات يقع في الطابق الثاني عند نهاية التوسعة السعودية الأولى.
ويتولى قسم المكتبة الصوتية أعمال حفظ ما يلقى في المسجد النبوي من دروس وخطب وصلوات، إضافة إلى قسم فني يختص بأعمال تجليد وترميم وتعقيم الكتب والمخطوطات، وفي حين يمثّل قسم الكتب النادرة أحد أهم الأقسام لما يحويه من كتب قديمة يتم حفظها وتدوين تاريخ طباعتها، فيما تمثّل المكتبة الرقمية جزءًا مهمًا من مكتبة المسجد النبوي، حيث تضمّ أجهزة الحاسب الآلي يستفيد رواد المكتبة منها في البحث عن الكتب والموضوعات المختلفة في أركان المكتبة الرقمية، وبرنامج المكتبة الشاملة، والمكتبة الإسلامية الكبرى، فضلًا عن أقسام البحث والترجمة، والإهداء، والإعارة، والفهرسة والتصنيف، والأمن والسلامة.